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红曲米(粉)

窖泥功能菌的纯化分离及在百年老窖上的应用

发布时间:2014-04-09    浏览次数:1384 次

窖池是浓香型大曲酒生产的基础设备,是酒醅发酵的密闭容器。窖泥作为其组分,与曲酒的生产关系密切。


    在酒醅长期发酵的过程中,经微生物发酵产生的有机酸、乙醇、酯香类物质等逐渐浸泡到窖泥中,窖泥作为粗制培养基,富集培养成产酯生香的厌氧功能菌,这些功能菌中的优势微生物群落为梭状芽孢杆菌,它能利用底物产生乙酸、丁酸及少量己酸,为生成白酒中的主题香味物质——己酸乙酯做基础物质。


    使用人工窖泥大大缩短了窖泥老熟的过程,为浓香型曲酒的质量奠定了基础。但以前由于我们人工窖泥的配方一直采用“七星北斗”工艺,培养配方不合理,菌种易老化,以及在生产过程的操作不当、养护不到位,致使一段时间后出现老化。


    过去,我们多采取定期更换窖泥的方法,但新更换的窖泥在一两年内又影响粮食酒的质量。自2001年以来,我们公司根据多年的研究,从自己的优质老窖池窖泥中分离适合自己的窖泥功能菌,同时更新窖泥配方,提出了打造百年老窖的新思路。


    窖泥功能菌是指栖息在优质老窖泥中,长期生长、代谢和繁殖,对浓香型白酒典型风格的形成起着关键作用的多种有益微生物群系。应用其培养的功能性窖泥是指通过强化有益功能菌的种类和数量,改善微生物的生长环境,使有益功能菌在良好的环境中,长期处于旺盛繁殖状态的人工窖泥。其主要特点为:使用功能性窖泥改造窖池,可加速新泥老熟,延长窖泥使用周期,改善窖泥风味,增加窖泥酯香,驱除窖泥臭味,防止窖泥老化,完善酒体风格,提高酒体质量。


    1.窖泥功能菌的分离与纯化


    1.1 试验材料


    1.1.1 我公司一车间30年以上窖龄的优质窖池池底窖泥。


    1.1.2 窖泥功能菌分离培养基:K2HPO4  0.04 %,(NH4)2SO4  0.05%,CH3COONa  0.5%,CaSO4  1% ,MgSO4  0.02%,酵母膏0.1%,乙醇2%,琼脂 2%,pH7。


    1.1.3 无菌吸管、试管、培养皿、生理盐水、活塞真空干燥器。


    1.2 试验方法


    1.2.1 系列稀释:称取10克窖泥,制成10-2、10-3、10-4、10-5 等不同浓度的悬液。


    1.2.2 倾倒平皿稀释:取3只培养皿,编号,选择适宜的稀释度10-3、10-4、10-5,分别从中吸取0.2mL悬液,加入空皿中,然后将经灭菌的固体培养基用水浴融化,待冷却至50—55度时,分别倒入平皿,每皿约倾倒15mL,迅速摇匀后置于桌面,整个过程应在酒精灯火焰附近操作。


    待培养基凝固后,将培养皿置于80kpa真空度的干燥器中,于32℃—34℃恒温培养5天。


    1.2.3 划线分离:左手持平皿,右手持接种针。用接种针在火焰上灭菌后,沾取一环适宜稀释度的悬液,在火焰附近用左手拇指、食指掀开皿盖,迅速划线,将平皿分成3个区域。划线后的培养皿置于80kpa真空度的干燥器内,于32℃—34℃恒温培养5天。


    1.2.4纯化:分离工作反复进行,直至获得满意的单菌落群培养为止。


    2.窖泥功能菌分离纯化过程中的检测和鉴定


    2.1 直观检验


    从平皿中选取生长良好的菌落,用接种环取一环接种于盛有巴氏液体培养基的细颈试管中,在厌氧条件下培养:


    第1—3天,基本上不产己酸;


    第4—6天,有少量气泡产生,菌种大量繁殖,并开始产己酸;


    第7—8天,成熟,颜色由白色转为淡黄色,最终pH 值为6.0—6.5,有突出的己酸味;


    继续培养至10—12天,产酸量达到高峰,经色谱分析,己酸含量达200—250mg/100mL。


    2.2 显微镜检查


    窖泥功能菌在显微镜下,菌体呈梭状,革兰氏染色阴性。其伴生菌是一种产甲烷菌,也是革兰氏阴性菌,但直径小于己酸菌;其污染菌丁酸菌是革兰氏阳性梭状芽孢杆菌。

2.3 目视法快速定性检查


    取发酵液1毫升置于小试管中,加2% CUSO4 溶液1毫升,有云雾状深蓝绿色沉淀,再加入乙醚0.5毫升,摇匀放置后分层,乙醚层呈蓝色。同时吸取不同深度浓度的己酸做成标准管,视发酵液颜色深浅与标准管比较,断定有无己酸产生及产己酸量的多少。


    3.窖泥功能菌加速新窖老熟的应用


    3.1 新窖池使用人工窖泥筑窖


    (1)培养人工窖泥工艺流程:功能菌试管→小三角瓶→大三角瓶→卡氏缸→大缸→活泥→培养。


    (2)培养方法


    试管、三角瓶窖泥功能菌种子培养:


    培养基:K2HPO4  0.04%,(NH4)2SO4  0.05%,CH3COONa  0.5%,CaSO4  0.5%,MgSO4  0.02%,CaCO3  0.5%,酵母膏0.1%,乙醇2%  琼脂 2%,pH7,于32℃—34℃恒温培养5天,培养液尽量充满容器,造成厌氧状态。


    卡氏缸大缸培养:


    培养基:新鲜酒糟出液85%,窖泥浸出液13%,酒精2% K2HPO  0.2%,CH3COONa  0.1%,MgSO4  0.1%,塑料布封口,于32℃—34℃恒温培养8天,进行质量检查,合格后备用。


    窖泥配方及操作:


    以黄土(大田土)、窖皮泥为基础,添加大曲粉、酒糟、酒尾、豆饼及营养盐、己酸菌液、沼气培养液作为营养基质和菌种来源,具体为:黄土 4800kg、窖皮泥500kg、液体磷铵60kg、优质黄水120kg、丢糟270kg、大曲粉60kg、酒尾40kg 、老窖泥富集培养液和己酸菌液、甲烷液等150kg。


    将以上材料混匀、堆积、封闭发酵,保温30℃,发酵1个月以上。


    新的人工窖泥配方与以往相比,不同之处:


    (1) 没有在黄泥中加入污泥。因为来自污泥的微生物大多是与酿酒发酵无关的细菌,这样培养的窖泥会带有异杂味。


    (2) 微生物种类比较丰富,如果只用己酸菌培养窖泥,会使产香成分单一,酒质不全面,从而影响质量。


    (3) 我们没有盲目添加窖泥微生物营养需要的水果、粮食原料等,而是加入黄水、尾酒等。


    (4) 没有像以前那样,为使窖泥带有特殊的香味,添加有机酸酯或植物花草等。因为浓香型白酒香味物质的生成,主要靠微生物酶的作用,培养窖泥的实质是培养泥中的优质有益菌类,而不是提供窖泥做增香来源。


    (5)没有把过磷酸钙、尿素等与黄泥等堆积起来发酵。这样做会因为缺少老窖泥培养液,而使发酵后的人工窖泥带氨臭味。使用窖泥功能菌培养的窖泥质量与传统工艺窖泥对比见表1、表2。




    3.2 非新窖池使用人工窖泥进行窖泥池的长期维护


    对于非新窖池,其窖泥使用了一段时间后,有的出现了白色针状结晶,这是窖泥老化的征兆,应及时补充营养或更新窖泥。


    在生产过程中文章来源华夏酒报,多数窖池内由于挖时的撞击,使部分窖泥脱落;有些窖泥由于池口管理不善,池口部分出现霉烂现象;还有些窖泥,尤其是窖泥池上部,因窖泥长期与水泥面接触,出现了大量的白色结晶,这是由于大量形成乳酸钙和乳酸铁的原因,这些现象都严重阻碍了窖泥功能菌的生长繁殖,影响了曲酒的质量,因此,需要人工窖泥及时维护。


    依照笔者的经验,窖泥不需要年年抹,因为窖泥使用后,窖泥功能菌的生长繁殖需要一个过程,并非使曲酒的己酸乙酯含量立即提高,一般需要从第二排开始才逐步发挥作用,曲酒中己酸乙酯的含量才会提高。窖池每年全部抹一遍是一种极大的浪费。因此,在使用窖泥时要有针对性,主要针对那些曲酒中己酸乙酯含量长期偏低的窖池,对于那些质量较好的,只要坚持使用窖泥功能菌液对窖池进行维护与保养,就能达到事半功倍的效果。


    3.3 应用己酸菌培养液对窖泥进行定期强化


    窖泥使用一段时间后,由于其中微生物的生长代谢,窖泥中营养成分逐渐减少,致使窖泥中功能菌活菌数大大减少,因此,需要对窖池定期补充营养成分,并使用窖泥功能菌营养液喷洒窖壁进行强化。


    4.结论


    大量的生产实践表明,新窖池由于使用功能菌,窖泥加速新窖老熟。经过大约1年的时间,曲酒中己酸乙酯的含量达到180mg/100mL以上,优质酒品率达到29%左右,相当于传统方法10年老窖的水平;而使用传统方法生产曲酒的窖池,同样1年的时间,曲酒中己酸乙酯的含量仅达到 60—80mg/100mL,优质酒品率达到22%左右(表3)。




    功能性窖泥的研究与应用加速了新窖老熟,减少了更换窖泥的频率,提前生产优质酒,减少新窖产酒的邪杂味和泥臭味,增加了粮食酒的主体香及其复杂的香味成分,改善了酒体风格,增强了绵柔度和纯净感,完全符合我们苏鲁豫皖名优酒厂倡导的“淡雅爽净”的风格特点。但再好的百年老窖,如果不注重日常的窖池养护或工艺操作不当,也同样会造成窖泥的老化。


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